• Make sure you do all the labwork in a laboratory equipped for work with radioactivity. Locate all containers for disposal of radioactive waste.
• Always use appropriate safety precautions, such as: gloves, labcoat and radiation screens.
• Wear your dosage meter.
• All pipette tips, tubes and other disposables should be autoclaved or certified RNA:ase free.
• Isotope, 35S, bound to ATP [Deoxyadenosine 5'-alpha-THIO Triphosphate] is obtained from e.g. ???? and stored at -20°C (or lower) in lead boxes as 6µl aliquots.
• Our oligo probes are kept in the isotope-lab.
•     (undiluted solutions from the manufacturer and stock solutions (400ng/µl) are stored at -20°C, while working solutions (40ng/µl) are kept at 4°C).

• Solutions are kept refrigerated or frozen in the isotope lab.

• Heat waterbath to 37°C
• Put tube with 6µl isotope aliquot on ice

• 1µl  probe (40ng/µl): labelling the tubes is a good idea at this point!
• 1.25µl ddH2O
• 2.5µl 5xCobolt buffer  (1.25 µl 10xCobolt buffer) Should not be kept thawed for extended periods
• 3 µl TdT [3'-terminal deoxynucleoside transferase]. Do not thaw!

• Spin down, mix only with pipette
• Incubate at 37°C in waterbath for 2-3 h.

kit för spinrening av oligos. Behöver innehåll i kit (kolonn, 2ml eppendorf, PN- samt PE buffert.) samt extra 2ml eppendorfrör, 10mM TRIS-HCL pH8.5. Ger konsistenta resultat!!

· Ta upp prober ur vattenbad och tillsätt buffer PN (10x probevolym à typiskt 130µl), blanda vål med pipettspets.
· Tillsätt lösningen till kolonn (OBS märk kolonn med probe identitet)som satts i 2ml eppendorf rör och spinn 1 min vid 6000rpm
· Sätt kolonner i nya 2ml eppendorf rör (kasta de gamla), Tillsätt till kolonn 500µl buffer PE (OBS då använder PE första gången skall 24ml etanol (95 el 99.5 %) tillsättas) och spinn 1min vid 6000rpm. För över kolonn till nya 2ml eppendorfrör (kasta de gamla) och repetera sköljning med 500µl buffer PE som tillsätts kolonner, spinn 1min vid 6000rpm.
· Töm 2ml eppendorfrör och sätt tillbaka kolonner, spinn bort kvarvarande vätska, 1min vid 13000rpm.
· För över kolonner till uppmärkta 1.5ml eppendorf rör, till rören tillsätts 200µl 10mM Tris-Hcl pH8.5, spinn 1min vid 13000rpm à har inmärkt & renad probe i röret.
Kontrollera primär probe i scint (4ml scintvätska i plaströr samt 2 µl av proben på filterpapper).
optimal inmärkning 500000-1000000 cpm. (program 35S, 1min)
OBS! vissa prober ger lägre aktivitet, och sådana kan man försöka köra med aktivitet kring 200000 cpm/2µl. I andra fall är det ofta bättre att märka om.
 
 

• Take out the slides (from freezer) and let them dry (4-6h)
• Heat waterbath to 42°C
• Make sure incubation "oven" is switched on at 42°C.

• 90 µl cocktail
• 5 µl salmon
• 4 µl 5M DTT

• Heat hybridisation "cocktail" for 60min in waterbath; leave the foil wrapping on the tubes
• Boil salmon for 5 min, and then keep it on ice
• Thaw 5M DTT
• Prepare the cocktail, salmon and DTT-mix in a 15ml falcon tube and keep it at 42°C

• Add 2 µl probe/100µl total solution to separate tubes (1.5ml)
• Finish the hybridisation solutions by adding appropriate amounts of cocktail, salmon and DTT-mix to probe tubes.Return the finished solutions to 42°C

• Carefully vortex the hybridisation solutions. No bubbles!
• Keep solutions at 42°C until they are applied to the slides

• Prepare incubation boxes with tissue strips soaked in ddH2O. Don't overdo it -condensation will form and can dilute your solutions!
• Apply hybridisation solutions, 150µl/slide. No bubbles!
• Cover with parafilm pieces, avoid catching bubbles or wrinkling the film

• Seal incubation box with tape
• Incubate overnight (12-18 h) at 42°C

• Heat waterbath to 55'C
• Heat bottles of 1X SSC in waterbath. Estimate usage to 2 liter 1X SSC/rack of 25 slides
• Remove the incubation box with the slides from the incubator oven
• Separate parafilm from slides in heated 1XSSC in a suitable beaker. If done carefully the film should separate promptly. Note that pulling the film off is not needed and should be avoided. Remember to dispose of this contaminated solution appropriately
• Place slides in racks in 1X SSC at 55°C (contained in the beakers designed to hold the racks)
• Rinse slides 4x15 min in 1X SSC at 55°C
• Cool the rinsed slides in the racks, at room temperature; cover with Al-foil (30min)
• Dehydrate:

• Dry slides covered with Al-foil; can be kept up to 24 hours at room temperature

• Use designed case (20 X 40 cm)
• Make sure to "erase" PI-plates before using them

• Tape clean white paper to metal surface (bottom)
• Place slides side by side, tissue face up and secure them by taping down across the label ends. These are preferrably organized towards the edges of the case.
• Place PI-plate's blue side (active) on the tissue of the slides.

• Carefully close the case and put it in a lead cabinet for the exposure duration (24-48h)

• Switch on PI-machine and the printer

1. Take one exposed PI-plate and place it in the reader-casette
2. Place the reader-casette in the PI-machine. Make sure it comes into its place correctly
3. Shut the reading tray carefully
4. Press start to initiate the reading
5. When finished, open the reading tray and remove the cassette
6. Remove the PI-plate and put it in the upper tray, blue facing upwards. The upper tray holds four plates and when activated resets the plates using white light (15min)
7. Save image (PCB-format) and print out a copy. Label the printout before removing the slides from the case

• Repeat 1-7 for every plate
• Remove all image files from the hard drive when done

• Estimate: 1 day PI-exposure equals 10 days of post-dipping exposure

a.)  Späd/Tina Dipemulsion- (mörkrum, värmeplatta, vattenbad)- Ta ut svart behållare med emulsion ur blylåda; om det inte finns uppspädd dipemulsion-späd dipemulsion 1:1 i ddH2O (tex mät upp 20ml ddH2O till glasbägare samt sleva till denna volym upp dipemulsionsgel till slutvolym 40ml) sätt glasbägare i vattenbad vid 40-45°C cirka 60-90 min. (emulsion gel vid 4°C; flytande vid 40°C)
Ta tillbaka dipemulsion till kylskåp i ISH/EM-lab.
Ta med all utrustning som behövs för dip (dipvanna, mätkolv, glasbägare, kleenex, handskar, underläggspapper, stålbox fylld med is, slides- noga sorterade efter diptid!!!, pappflak för att lägga slides på mm?) och gå in i mörkrum, lås alla dörrar, sätt för mörkgardiner (2st), adaptera till skenet av natriumlampan (säkert arbetsavstånd ca. 30cm)

b.)  Dippa- fyll dipvanna med dipemulsion (låt stå i vattenbad under hela dipsessionen!!) ca. 5mm från övre kant; dippa 2 glas åt gången liggande rygg mot rygg, i 10s ; för glasen ned samt upp i jämnt lugnt tempo; dutta glas försiktigt mot kleenex för att få bort excess av dipemusion på distala kanten; för försiktigt isär glasen och torka av dem på baksidan; lägg sedan glasen horisontellt på isfyllda stålboxen (à torkar snabbare); överför sedan glasen till pappflak för definitiv torkning (tar 2-3 timmar); var noga med att fylla på dipemulsion efter hand.Då man går ut ur mörkrum, se till att stänga mörkgardiner efter sig; stäng av eller skym natriumlampan under torktid.              Överbliven dipemulsion hälls över i plaströr, vilka i sin tur läggs in i blycylindrar- märk dessa med   datum, samt om emusionen dippats i eller ej.

c.)  Packning- Under tiden som glasen torkar förbered boxar i vilka glasen skall exponeras- lägg ett tunt lager med 1-3 mm blågel i botten, täck med filterpapper (OBS-blågel absorberar fukt och skall tas “färsk” ur värmeskåp- blå=torr, vit=fuktig); märk boxar med relevanta uppgifter- dipdatum, diptid, box#, vävnad, subst, namn.
Då glas torkat, gå in i mörkrum under iakttagande av strikt mörkerdisciplin. Överför de torkade glasen till relevanta boxar; då alla glas är iplockade och locken till boxarna påsatta tejpas boxen runt om för att minimera risken för ljusinsläpp. De fyllda boxarna läggs sedan i blylådor för transport till och lagring i kylskåp vid 4°C i ISH/EM-lab.